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Jul 27, 2023

TDP

Molecular Neurodegeneration Band 18, Artikelnummer: 57 (2023) Diesen Artikel zitieren 1281 Zugriffe 26 Altmetric Metrics Details Einschlüsse des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP-43) wurden benannt

Molecular Neurodegeneration Band 18, Artikelnummer: 57 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Einschlüsse des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP-43) wurden als limbisch vorherrschende, altersbedingte TDP-43-Enzephalopathie (LATE) mit oder ohne gleichzeitigem Auftreten der Alzheimer-Krankheit (AD) bezeichnet. Ungefähr 30–70 % der AD-Fälle weisen eine TDP-43-Proteinopathie (AD-TDP) und eine größere Schwere der Erkrankung im Vergleich zu AD-Patienten ohne TDP-43-Pathologie auf. Es bleibt jedoch unklar, inwieweit eine TDP-43-Dysfunktion an der AD-Pathogenese beteiligt ist.

Um zu untersuchen, ob die TDP-43-Dysfunktion ein herausragendes Merkmal in AD-TDP-Fällen ist, haben wir untersucht, ob nicht konservierte kryptische Exons, die als Marker für die TDP-43-Dysfunktion bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) und frontotemporaler Lappendegeneration (FTLD) dienen, TDP) reichern sich in AD-TDP-Gehirnen an. Wir untersuchten eine Kohorte von 192 postmortalen Gehirnen aus drei verschiedenen Gehirnregionen: Amygdala, Hippocampus und frontaler Kortex. Nach der RNA- und Proteinextraktion wurden qRT-PCR und Immunoassays durchgeführt, um die Anhäufung kryptischer RNA-Ziele bzw. die Pathologie von phosphoryliertem TDP-43 zu quantifizieren.

Wir haben die Anhäufung falsch gespleißter kryptischer oder skiptischer RNAs von STMN2, KCNQ2, UNC13A, CAMK2B und SYT7 in der Amygdala und im Hippocampus von AD-TDP-Fällen festgestellt. Die topografische Verteilung der kryptischen RNA-Akkumulation ähnelte der von phosphoryliertem TDP-43, unabhängig von der Klassifizierung des TDP-43-Subtyps. Darüber hinaus konnten kryptische RNAs AD-TDP-Fälle effizient von Kontrollen unterscheiden.

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass kryptische RNAs ein interessantes neues therapeutisches und diagnostisches Ziel bei AD darstellen könnten und dass Methoden zum Nachweis und zur Messung dieser Spezies in Bioflüssigkeiten von Patienten als zuverlässiges Instrument zur Beurteilung der TDP-43-Pathologie bei AD eingesetzt werden könnten. Unsere Arbeit wirft auch die Möglichkeit auf, dass die TDP-43-Dysfunktion und die damit verbundenen Veränderungen beim kryptischen Spleißen einen gemeinsamen molekularen Mechanismus darstellen könnten, der AD-TDP und FTLD-TDP gemeinsam hat.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist weltweit die häufigste Ursache für Demenz und zeigt einen schleichenden Beginn mit einem allmählichen Fortschreiten des Gedächtnisverlusts und des kognitiven Verfalls. Die neuropathologischen Mechanismen der AD hängen mit Anomalien der Proteine ​​β-Amyloid und Tau zusammen, die sich in neuritischen Plaques bzw. neurofibrillären Knäueln (NFTs) ansammeln [1]. Ungefähr 30–70 % der AD-Patienten sind auch von einer TAR-DNA-bindenden Protein-43-kDa-Proteinopathie (TDP-43) betroffen [2,3,4,5,6,7,8]. Tatsächlich kann eine TDP-43-Pathologie in alternden Gehirnen gefunden werden, die als limbisch-vorherrschende, altersbedingte TDP-43-Enzephalopathie (LATE) bezeichnet wird und möglicherweise mit neuropathologischen Veränderungen bei AD einhergeht [9,10,11]. TDP-43 ist ein RNA-bindendes Protein, das stark mit der Mehrzahl der Fälle von amyotropher Lateralsklerose (ALS) und etwa 50 % der Fälle von frontotemporaler Lappendegeneration (FTLD-TDP) verknüpft ist [12, 13]. AD-Fälle mit TDP-43-Proteinopathie (AD-TDP) weisen im Vergleich zu AD-Patienten ohne TDP-43-Pathologie eine höhere Krankheitsschwere auf, die durch ein schlechteres Gedächtnis und eine stärkere Atrophie des Hippocampus gekennzeichnet ist [14,15,16]. Derzeit besteht ein Mangel an Verständnis über die Mechanismen, die der TDP-43-assoziierten Neurodegeneration bei der AD-Pathogenese zugrunde liegen.

TDP-43 ist ein Kernprotein mit einer Rolle bei der Aufrechterhaltung der RNA-Homöostase [17,18,19]. Bei TDP-43-Proteinopathien wird TDP-43 unlöslich und aggregiert entweder im Zellkern oder lokalisiert sich fehl am Zytoplasma und bildet dort Einschlüsse – was letztendlich zum Verlust seiner Kernfunktion führt [12, 13, 20]. Das molekulare Muster der TDP-43-Ablagerung wurde verwendet, um ein Stadienschema für AD-TDP festzulegen [21,22,23]: In den ersten Stadien wird die Amygdala befallen, gefolgt von einem Fortschreiten in die Hippocampusregionen. In den schwersten und fortgeschrittensten Fällen können auch TDP-43-Einschlüsse im frontalen Kortex nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu werden in FTLD-TDP-Fällen TDP-43-positive Einschlüsse zunächst in der Amygdala nachgewiesen, breiten sich aber über den medialen Frontalkortex und den Hippocampus aus und breiten sich in späteren Stadien in Richtung motorischer Kortex, Rückenmark und Hinterhauptslappen aus [24] . Darüber hinaus ist die histopathologische Musterablagerung von TDP-43 heterogen und wurde zur Klassifizierung von TDP-43-Fällen in verschiedene Subtypen verwendet. In etwa 54 % der AD-TDP-Fälle ähneln TDP-43-Einschlüsse den in FTLD-TDP-Typ-A-Fällen beschriebenen Aggregaten, die durch neuronale zytoplasmatische und intranukleäre Einschlüsse sowie dystrophische Neuriten gekennzeichnet sind und weiter verbreitet sind (AD-TDP Typ α). ) [25, 26]. In den verbleibenden 46 % der AD-TDP-Fälle gehen TDP-43-Einschlüsse mit TDP-43 einher, das mit NFTs assoziiert ist und als AD-TDP Typ β bezeichnet wird [25, 26]. Obwohl AD-TDP und FTLD-TDP nach unterschiedlichen neuropathologischen und klinischen Erscheinungsformen klassifiziert werden, deutet die TDP-43-Dysfunktion bei beiden Erkrankungen darauf hin, dass ihnen ein gemeinsamer molekularer Mechanismus zugrunde liegt.

Die Rolle von TDP-43 als Spleißrepressor hat in letzter Zeit erhöhte Aufmerksamkeit erhalten, da festgestellt wurde, dass der Verlust der TDP-43-Funktion zum Einschluss nicht konservierter kryptischer Exons in ALS/FTLD-TDP- und AD-Fällen führt [19, 27, 28,29,30,31,32,33,34]. Die beiden am häufigsten untersuchten kryptischen RNAs sind die kryptischen Transkriptvarianten von Stathmin-2 (STMN2) und unc-13-Homolog A (UNC13A). STMN2 ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Phosphoprotein, das an der Signalübertragung und dem neuronalen Wachstum beteiligt ist (31, 32, 35) und eine Rolle bei der Aufrechterhaltung neuromuskulärer Verbindungen spielt (36, 37, 38, 39). Während UNC13A, ein Gen, das ALS- und FTD-assoziierte Risikovarianten beherbergt, ein Protein kodiert, das an der Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt ist [29, 30]. Beide kryptischen Spezies reichern sich im frontalen Kortex von FTLD-TDP-Fällen an und gehen mit der Belastung durch phosphoryliertes TDP-43 (pTDP-43) einher. Darüber hinaus sind sie auch mit einem früheren Erkrankungsalter und einer kürzeren Überlebenszeit verbunden [29, 35]. Das Schicksal verschiedener kryptischer RNAs ist unterschiedlich: Einige Arten, darunter die kryptischen Formen von STMN2 und UNC13A, bauen vorzeitige Stoppcodons ein, was zu ihrem schnellen Abbau ohne Übersetzung führt. Im Gegensatz dazu werden andere kryptische RNAs effektiv übersetzt, und in Neuronen und der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) von ALS-Patienten mit oder ohne frontotemporaler Demenz (FTD) wurden neue Peptide nachgewiesen (34, 40), die möglicherweise als Marker für eine TDP-43-Dysfunktion dienen . Unabhängig davon, ob die kryptische RNA zu einer verkürzten Variante führt oder nicht, führt die Anhäufung kryptischer RNAs zu einer Herunterregulierung der entsprechenden Volllängen-RNA- und Proteinvarianten, von denen viele eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung neuronaler Funktionen spielen [29,30,31, 32, 35, 41]. Die Rettung dieser Missplicing-Ereignisse könnte einen neuen Ansatz zur Minderung der TDP-43-bedingten Neurotoxizität darstellen [32, 42]. Daher könnte die Akkumulation kryptischer RNA aufgrund einer TDP-43-Dysfunktion nicht nur das Potenzial haben, als Biomarker zur Stratifizierung von Patienten mit und ohne TDP-43-Pathologie zu fungieren, sondern auch wichtige therapeutische Implikationen für TDP-43-Proteinopathien haben.

Obwohl bei ALS/FTLD-TDP-Fällen systematisch über abweichende kryptische Transkripte berichtet wurde, war das Ausmaß der Akkumulation dieser RNAs bei anderen TDP-43-Proteinopathien wie AD unbekannt. Daher wollten wir untersuchen, ob sich in FTLD-TDP nachgewiesene kryptische RNAs auch in AD-TDP in drei Gehirnregionen ansammeln, die unterschiedlich von der TDP-43-Ablagerung betroffen sind (Amygdala, Hippocampus und frontaler Kortex) [21,22,23]. Im Vergleich zu kognitiv normalen Kontrollpersonen und AD-Fällen ohne TDP-43-Pathologie sammelten AD-TDP-Fälle kryptische RNAs in den Regionen an, die am stärksten von TDP-43-Ablagerungen betroffen waren. Ähnlich wie bei FTLD-TDP wurden einige kryptische RNAs in AD-TDP am besten mit den pTDP-43-Spiegeln in Verbindung gebracht und von TDP-43-Negativkontrollen unterschieden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass verschiedene TDP-43-Proteinopathien möglicherweise gemeinsame pathologische Mechanismen aufweisen und TDP-43-zielgerichtete Interventionen und damit verbundene diagnostische Instrumente bei mehreren Erkrankungen, einschließlich AD-TDP und FTLD-TDP, von Nutzen sein können.

Menschliches postmortales Gehirngewebe aus Amygdala, Hippocampus und frontalem Kortex wurde von der Mayo Clinic Florida Brain Bank bereitgestellt. Die Diagnose wurde unabhängig von ausgebildeten Neurologen und Neuropathologen anhand neurologischer bzw. pathologischer Untersuchungen gestellt. Alle Teilnehmer oder die nächsten Angehörigen gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und alle Protokolle wurden vom Institutional Review Board und der Ethikkommission der Mayo Clinic überprüft und genehmigt. Die Proben wurden auf der Grundlage der neuropathologischen Diagnose von FTLD-TDP, AD mit und ohne TDP-43-Pathologie und kognitiv normalen Kontrollpersonen ausgewählt. Bemerkenswert ist, dass das Vorhandensein/Fehlen von Lewy-Körpern kein Kriterium für die Probenauswahl war. Insgesamt 15 AD-TDP-Fälle (21 %) hatten Lewy-Körperchen in der Amygdala, aber keiner hatte Lewy-Körperchen im Hirnstamm oder in der Hirnrinde. Die Größe der Studienkohorte wurde durch die Probenverfügbarkeit für alle drei Gehirnregionen und die verfügbare Charakterisierung des TDP-43-Subtyps bestimmt. In die Studie wurden sowohl Männer als auch Frauen einbezogen. Eine Zusammenfassung der Studienkohorte ist in Tabelle 1 beschrieben.

Die Immunhistochemie wurde an 5 µm dicken Schnitten von formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe durchgeführt, das auf Glasobjektträgern montiert war. Die Schnitte wurden entparaffiniert und für Phospho-TDP-43 (pS409/410, Maus monoklonal, 1:5.000; Cosmo Bio, Tokio, Japan) [25] und Thioflavin S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) für Braak verarbeitet Staging [43] und Thal-Phasing [44] gemäß zuvor veröffentlichten Methoden.

Um die pTDP-43-Protein- und kryptischen RNA-Spiegel zu bestimmen, wurden 50–60 mg menschliches Gewebe für Protein- und 40 mg Gewebe für RNA-Extraktionen aus der Amygdala, dem Hippocampus und dem Frontalcortex präpariert. Konkret wurde die Amygdala aus einem koronalen Abschnitt auf der Höhe des Uncus, der Hippocampus aus einem koronalen Abschnitt auf der Höhe des lateralen Kniehöckers und die Proben des mittleren Frontalgyrus aus dem Brodmann-Bereich 9 herausgeschnitten.

Um pTDP-43 aus postmortalen Geweben zu messen, führten wir eine Proteinfraktionierung wie zuvor beschrieben durch [45]. Kurz gesagt, die Gewebe wurden in 5 Volumina (w/v) kaltem RIPA-Puffer (25 mM Tris-HCl [pH 7,6], 150 mM NaCl, 1 % Natriumdesoxycholat, 1 % Nonidet P-40, 0,1 % Natriumdodecylsulfat, und Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail), auf Eis beschallt und 30 Minuten lang bei 4 °C und 100.000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde dann als RIPA-lösliche Fraktion gesammelt. Das Pellet wurde in RIPA-Puffer resuspendiert, beschallt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das verbleibende Pellet wurde in Harnstoffpuffer (30 mM Tris-HCl [pH 8,5], 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff und 4 % CHAPS [(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]- 1-Propansulfonat]) für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Rühren. Nach der Inkubation wurden die Proben mit Ultraschall behandelt und 30 Minuten lang bei 22 °C mit 100.000 xg zentrifugiert. Der resultierende Überstand, der als harnstofflösliche oder RIPA-unlösliche Fraktion bezeichnet wird, war dann gesammelt. Die Proteinkonzentrationen der harnstofflöslichen Fraktionen wurden durch den Bradford-Assay (ThermoFisher) bestimmt.

Die Bewertung von pTDP-43 wurde in der harnstofflöslichen Fraktion aus der Amygdala, dem Hippocampus und dem Frontalcortex unserer Studienkohorte unter Verwendung eines Sandwich-Meso-Scale-Discovery-Immunoassays (MSD) durchgeführt [45]. Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der für an den Serinen 409/410 phosphoryliertes TDP-43 spezifisch ist (3 µg/ml, 22309-1-AP, Proteintech), wurde zum Einfangen verwendet, und ein sulfomarkierter polyklonaler C-terminaler TDP-43-Kaninchen-Antikörper (3). µg/ml, 12892-1-AP, Proteintech) zum Nachweis. Alle Proben wurden in doppelten Vertiefungen getestet und in jeder Platte waren Kontrollen enthalten, um etwaige Schwankungen zwischen den Platten zu berücksichtigen. Die MSD QUICKPLEX SQ120-Technologie wurde verwendet, um die Reaktionswerte zu erfassen, die der Intensität des emittierten Lichts bei elektrochemischer Stimulation entsprechen.

Die RNA wurde mit dem RNAeasy Plus Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor beschrieben extrahiert [35, 45]. RNA aus bis zu drei Schnitten wurde extrahiert und nur Extraktionen mit hochwertiger RNA wurden für nachgelagerte Analysen aufbewahrt. Die RNA-Konzentration wurde mithilfe von Nanodrop-Technologien (Thermo Fisher) bestimmt und ein Agilent 2100-Bioanalysator (Agilent Technologies) wurde zur Bewertung der RNA-Integritätszahl (RIN) verwendet. Die mittleren RIN-Werte für alle Proben lagen für alle Gehirnregionen bei > 9 (Tabelle S1).

Nach der RNA-Extraktion wurden 500 ng Gesamt-RNA mithilfe des High-Capacity cDNA Transcription Kit (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Anschließend wurde eine quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung von SYBR GreenER qPCR SuperMix (Invitrogen) auf einem QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Alle Proben aus Amygdala, Hippocampus und frontalem Kortex wurden gleichzeitig untersucht, und Kontrollproben wurden in jede Platte einbezogen, um etwaige Variabilität zwischen den Platten zu berücksichtigen. Die relative Quantifizierung kryptischer RNAs wurde mithilfe der ΔΔCt-Methode bestimmt und auf zwei endogene Kontrollen, GAPDH und RPLP0, normalisiert. Die folgenden Primer wurden verwendet: kryptisches STMN2 vorwärts: 5'-GGACTCGGCAGAAGACCTTC-3', kryptisches STMN2 rückwärts: 5'-GCAGGCTGTCTGTCTCTCTC-3'; Skiptic KCNQ2 vorwärts: 5′-TATGCCCACAGCAAGATCAC-3′, Skiptic KCNQ2 rückwärts: 5′-AGACACCGATGAGGGTGAAG; kryptische UNC13A vorwärts: 5′-TGGATGGAGAGATGGAACCT, kryptische UNC13A rückwärts: 5′-GGGCTGTCTCATCGTAGTAAAC; kryptisches CAMK2B vorwärts: 5′-CTGCTCCGTGGTCTTAATGAT, kryptisches CAMK2B rückwärts: 5′-GAGTGCAGAGACTTCCCCC; kryptischer SYT7-Forward: 5′-GCAGTGAGAAGAAGGCTATCAA; kryptisches SYT7-Reverse-5′-CGGCAGACTGGAGCCT; GAPDH vorwärts: 5'-GTTCGACAGTCAGCCGCATC, GAPDH rückwärts: 5'-GGAATTTGCCATGGGTGGA; und RPLP0 vorwärts: 5′-TCTACAACCCTGAAGTGCTTGAT; RPLP0-Rückseite: 5′-CAATCTGCAGACAGACACTGG.

Statistische Analysen wurden in GraphPad Prism 9 (GraphPad Software) durchgeführt. Um Unterschiede in den pTDP-43-Protein- oder kryptischen RNA-Spiegeln zwischen Krankheitsfällen und Kontrollen zu bewerten, führten wir für jede Region eine einfaktorielle ANOVA durch, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstests, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Beim Vergleich der kryptischen RNA-Spiegel zwischen AD-TDP- und AD-kein-TDP-Fällen wurde der Mann-Whitney-Test verwendet. Darüber hinaus führten wir auch einvariable (unbereinigte) und multivariable lineare Regressionsmodelle (bereinigt) durch, um Unterschiede zwischen AD-TDP und anderen Studiengruppen zu bewerten (Tabellen). Multivariable Modelle wurden hinsichtlich Sterbealter, Geschlecht und RIN für kryptische RNAs und hinsichtlich Sterbealter und Geschlecht für pTDP-43-Protein angepasst. Aufgrund der verzerrten Verteilung der Daten wurden kryptische RNA und pTDP-43 auf der logarithmischen Skala zur Basis 10 analysiert. Die Regressionskoeffizienten (β) und 95 %-Konfidenzintervalle (CIs) wurden geschätzt und als Differenz der Mittelwerte, basierend auf der 10er logarithmischen Skala, zwischen allen AD-TDP-Fällen (Referenzgruppe) und den anderen Studiengruppen interpretiert. Für pTDP-43 wurden P-Werte unter 0,0167 als statistisch signifikant angesehen, nachdem die drei separaten Analysen AD-TDP vs. CN, AD-TDP vs. AD ohne TDP und AD-TDP vs. FTLD-TDP berücksichtigt wurden. Für kryptische RNA wurden P-Werte von weniger als 0,025 als statistisch signifikant angesehen, nachdem die drei separaten Analysen AD-TDP vs. Kontrollen (CN + AD kein TDP) und AD-TDP vs. FTLD-TDP berücksichtigt wurden.

Zusammenhänge zwischen kryptischer RNA und pTDP-43-Proteinspiegeln wurden in AD-TDP- und FTLD-TDP-Fällen mithilfe von linearen Regressionsmodellen mit einer Variablen und mehreren Variablen bewertet. Sowohl die kryptische RNA- als auch die pTDP-43-Proteinspiegel wurden mithilfe der logarithmischen Basis-10-Skala analysiert. Das multivariable Modell wurde hinsichtlich Alter, Geschlecht, RIN und TDP-43-Subtyp angepasst und P-Werte < 0,01 wurden als statistisch signifikant angesehen. Zur Beurteilung der Unterschiede in den kryptischen RNA-Spiegeln innerhalb der TDP-43-Subtypen wurden in AD-TDP und FTLD-TDP auch ein- und multivariable lineare Regressionsmodelle wie beschrieben durchgeführt, wobei TDP-43 Typ A/α als Referenz festgelegt wurde Gruppe. Das multivariable Modell wurde an Alter, Geschlecht, RIN und pTDP-43-Spiegel angepasst und P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Um die Fähigkeit kryptischer RNAs zu bewerten, AD-TDP- oder FTLD-TDP-Fälle von Kontrollen zu unterscheiden, haben wir die Fläche unter der Receiver Operating Characteristic Curve (AUC) zusammen mit einem 95 %-Konfidenzintervall (CI) für jede der kryptischen RNAs in geschätzt jede Region. Bemerkenswert ist, dass ein AUC-Wert von 0,5 einer Vorhersagefähigkeit entspricht, die der des Zufalls entspricht, und eine AUC von 1,0 eine perfekte Vorhersagefähigkeit darstellt.

Unsere Studienkohorte umfasste insgesamt 192 postmortale Fälle, die in vier Hauptgruppen eingeteilt wurden: 27 kognitiv normale (CN) Fälle (medianes Braak-NFT-Stadium II, Thal-Phase 0), 27 AD-Fälle ohne TDP-43-Pathologie (AD kein TDP), 71 AD-Fälle mit bestätigter TDP-43-Pathologie (AD-TDP) und 67 FTLD-TDP-Fälle (Tabelle 1). Alle AD-Fälle hatten ein mittleres Braak-NFT-Stadium von VI und eine Thal-Phase von 5, während FTLD-TDP-Fälle ein niedrigeres Braak-NFT (Median I-II, Bereich: 0 bis IV-V) und eine Thal-Phase (Median 1, Bereich: 0) aufwiesen –5) (Tabelle 1). Das mittlere Sterbealter für die AD-TDP-Gruppe betrug 84 Jahre, das mittlere Sterbealter der FTLD-TDP lag mit 71 Jahren niedriger und das mittlere Sterbealter für CN und AD ohne TDP-43 betrug 79 bzw. 78 Jahre (Tabelle 1). Unsere Studie schloss, je nach Gewebeverfügbarkeit, wenn möglich eine ähnliche Anzahl von Männern und Frauen ein. Die AD-TDP- und CN-Gruppen wiesen den höchsten bzw. niedrigsten Anteil an Frauen auf (Tabelle 1). Die Krankheitsdauer in AD-Fällen betrug unabhängig vom Vorliegen einer TDP-43-Pathologie 9–10 Jahre und das mittlere Erkrankungsbeginnalter lag bei 70–73 Jahren (Tabelle 1). Wie erwartet war die Krankheitsdauer bei FTLD-TDP-Fällen kürzer (Median 5 Jahre, Bereich: 1–25 Jahre) und der Krankheitsbeginn erfolgte früher (Median 64 Jahre, Bereich: 42–90 Jahre) (Tabelle 1). Sowohl die AD-TDP- als auch die FTLD-TDP-Gruppe umfassten eine ähnliche Anzahl von Fällen aus zwei TDP-43-Subtypen: Typ α (N = 36) und β (N = 35) bei AD-TDP und Typ A (N = 32) und B (N = 35) in FTLD-TDP (Tabelle 1).

Um die TDP-43-Dysfunktion bei AD-TDP zu beurteilen, haben wir zunächst postmortales Hirngewebe aus drei verschiedenen Hirnregionen untersucht: Amygdala, Hippocampus und frontaler Kortex. Die Kriterien für die Auswahl dieser spezifischen Bereiche basierten auf dem TDP-43-Ablagerungsschema bei AD, das eine anfängliche TDP-43-Akkumulation in der Amygdala (Stadium 1) beschreibt, gefolgt von einer Pathologie im Hippocampus und im Gyrus occipitotemporale (Stufen 2–3), im basalen Vorderhirn und ventrales Striatum (Stadien 4–5) und zuletzt im frontalen Kortex (Stadium 6) (Abb. 1A) [21,22,23]. Wichtig ist, dass dieselben Regionen bekanntermaßen die TDP-43-Pathologie bei FTLD-TDP akkumulieren [24, 46], sodass wir beurteilen können, ob Veränderungen, die aus einer TDP-43-Dysfunktion bei FTLD-TDP resultieren, auch bei AD-TDP beobachtet werden. Da pTDP-43 ein empfindlicher und spezifischer Marker für die TDP-43-Pathologie ist [29, 35, 45], haben wir die pTDP-43-Proteinspiegel in allen drei Gehirnregionen mithilfe eines auf Meso Scale Discovery (MSD) basierenden Immunoassays quantifiziert. Wir fanden eine signifikante Anreicherung von pTDP-43-Protein in der harnstofflöslichen Fraktion aller drei Regionen (Amygdala, Hippocampus und frontaler Kortex) von FTLD-TDP-Fällen (Abb. 1B). Bei AD-TDP waren die pTDP-43-Proteinspiegel in der Amygdala, der hauptsächlich von der TDP-43-Pathologie betroffenen Region, deutlich erhöht; Auch im Hippocampus waren die Werte deutlich erhöht, wenn auch in geringerem Maße (Abb. 1B). Im Frontalkortex von AD-TDP-Fällen wurde keine signifikante pTDP-43-Akkumulation gefunden (Abb. 1B), was mit der AD-TDP-Pathophysiologie übereinstimmt, bei der ein sehr kleiner Anteil der Fälle eine TDP-43-Pathologie in dieser Region aufweist [21,22,23]. ]. Wie erwartet zeigten alle Kontrollfälle, unabhängig von ihrer Klassifizierung als kognitiv normal (CN) oder AD ohne TDP-43 (AD ohne TDP), in keiner Region eine pTDP-43-Akkumulation (Abb. 1B). Darüber hinaus war die Akkumulation von pTDP-43 in der Amygdala und im Hippocampus von AD-TDP-Fällen im Vergleich zu den Kontrollen (CN und AD ohne TDP) signifikant erhöht und nach Anpassung an Geschlecht und Alter beim Tod signifikant niedriger als bei FTLD-TDP-Fällen ( Tabelle S2).

Die TDP-43-Pathologie häuft sich in der Amygdala und im Hippocampus von AD-TDP. (A) Grafischer Überblick über das AD-TDP-Stadium basierend auf dem TDP-43-Ablagerungsmuster aus der Amygdala (Stadium 1), gefolgt vom Hippocampus und dem Gyrus occipitotemporalis (Stufen 2–3), dem basalen Vorderhirn und dem ventralen Striatum (Stufen 4–5) und zuletzt im Frontalcortex (Stadium 6). Erstellt mit BioRender.com. (B) Quantifizierung der pTDP-43-Proteinspiegel in kognitiv normalen Kontrollen (CN), AD- und FTLD-Kohorten in drei Gehirnregionen: Amygdala, Hippocampus und frontaler Kortex (siehe Tabelle 1), mithilfe eines Immunoassays (siehe Methoden). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Zahl der Fälle ist in den Zahlen enthalten. Statistische Analysen wurden mittels einfaktorieller ANOVA nach Dunns Mehrfachvergleichstests durchgeführt: *P < 0,05, **P < 0,005, *** P < 0,0005, ****P < 0,0001, ns: nicht signifikant

Nachdem wir das Vorhandensein einer TDP-43-Pathologie in verschiedenen Regionen des AD-TDP- und FTLD-TDP-Gehirns bestätigt hatten, versuchten wir als nächstes zu bewerten, ob dieselben Regionen Hinweise auf eine TDP-43-Dysfunktion zeigten. Die aberrante Anreicherung kryptischer RNA-Ziele in ALS- und FTLD-Geweben mit TDP-43-Pathologie (z. B. frontaler Kortex, motorischer Kortex, Rückenmark usw.) stand im Mittelpunkt neuerer Studien [29,30,31,32, 34, 35]. Diese Studien ergaben, dass in Abwesenheit von TDP-43 kryptische RNAs von Genen exprimiert werden, die Schlüsselfunktionen in neuronalen Netzwerken haben. Insbesondere kryptische RNAs, die von STMN2 (neuronales Wachstum, axonale Regeneration, Signaltransduktion), KCNQ2 (neuronale Erregbarkeit), UNC13A (Neurotransmitterfreisetzung an der Synapse), CAMK2B (neuronale Plastizität und Synapsenbildung) und SYT7 (Exozytose von sekretorischen und synaptische Vesikel) wurden im frontalen Kortex von ALS und FTLD-TDP validiert [29, 34, 35]. Darüber hinaus sind einige als Peptide im ALS/FTD-Liquor nachweisbar [34]. Tatsächlich haben wir in dieser Studienkohorte die Akkumulation von fünf kryptischen RNAs im frontalen Kortex von FTLD-TDP validiert (Abb. S1, Tabelle S3). Bemerkenswert ist, dass wir keine signifikante Anhäufung von AD-TDP-Fällen im frontalen Kortex feststellen konnten, was höchstwahrscheinlich auf die geringe TDP-43-Pathologie in dieser Region zurückzuführen ist (siehe Abb. 1). Im Gegensatz dazu fanden wir signifikante Ansammlungen kryptischer RNAs sowohl in der Amygdala (Abb. 2A) als auch im Hippocampus (Abb. 2B) von AD-TDP im Vergleich zu Kontrollen (Strg: CN + AD kein TDP), selbst nach Anpassung an potenzielle Störvariablen [ Sterbealter, Geschlecht und RNA-Integritätszahl (RIN), Tabelle S4]. Bemerkenswert ist, dass wir CN- und AD-Gruppen ohne TDP kombiniert haben, die hier als Kontrollen bezeichnet werden, da beide Gruppen negativ für die Akkumulation von pTDP-43 sind. Dennoch wurden ähnliche Ergebnisse beim Vergleich von AD-TDP mit AD ohne TDP gefunden (Abb. S2). Darüber hinaus schien die Akkumulation kryptischer RNAs bei FTLD-TDP größer zu sein, war jedoch nach Anpassung an Sterbealter, Geschlecht und RIN nicht signifikant höher als bei AD-TDP (Tabelle S4). Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass AD mit TDP-43-Pathologie kryptische RNAs in Hirnregionen ansammelt, die von der TDP-43-Pathologie betroffen sind.

Aberrante kryptische RNAs reichern sich in der Amygdala und im Hippocampus von AD-TDP an. Kryptische RNA-Spiegel (STMN2, KCNQ2, UNC13A, CAMK2B und SYT7) wurden durch qRT-PCR in Amygdala (A) und Hippocampus (B) der Kontrollen gemessen (Strg: CN, dargestellt durch weiße Kreise + AD kein TDP, dargestellt durch Orange). Kreise), AD-TDP- und FTLD-TDP-Fälle. Die Zahl der Fälle ist in den Zahlen enthalten. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Analysen wurden mittels einfaktorieller ANOVA nach Dunns Mehrfachvergleichstests durchgeführt: *P < 0,05, **P < 0,005, *** P < 0,0005, ****P < 0,0001, ns: nicht signifikant

In früheren Studien haben wir und andere gezeigt, dass die pTDP-43-Belastung stark mit den Spiegeln kryptischer RNAs im frontalen Kortex von ALS und FTLD-TDP zusammenhängt. Wir beobachteten auch eine Korrelation zwischen den pTDP-43-Spiegeln und der Akkumulation aller fünf kryptischen RNAs im frontalen FTLD-TDP-Kortex (Tabelle S5). Interessanterweise war die Korrelation von pTDP-43-Protein und kryptischen RNAs im frontalen Kortex und in der Amygdala am signifikantesten, im Hippocampus jedoch weniger stark (Tabelle S5). Bei AD-TDP fanden wir signifikante Assoziationen zwischen kryptischen RNAs und pTDP-43 sowohl in der Amygdala als auch im Hippocampus, selbst nach Anpassung an Todesalter, Geschlecht, RIN und TDP-43-Subtyp (Tabelle 2). Unter allen untersuchten kryptischen RNAs war die kryptische KCNQ2-RNA durchweg mit einer höheren pTDP-43-Belastung in beiden Hirnregionen verbunden (Tabelle 2).

Als nächstes versuchten wir zu bewerten, ob die Art und Verteilung der TDP-43-Einschlüsse mit den Mengen kryptischer RNAs zusammenhängt. Bei FTLD-TDP sind TDP-43 Typ A und B die häufigsten Subtypen. TDP-43 Typ A weist die am weitesten verbreitete TDP-43-Pathologie auf und weist ein breiteres Spektrum an Einschlusstypen auf, während TDP-43 Typ B überwiegend durch neuronale zytoplasmatische Einschlüsse gekennzeichnet ist und manchmal mit Motoneuronerkrankungen assoziiert ist [47]. In unserer Studienkohorte beobachteten wir, dass FTLD-TDP Typ B tendenziell eine geringere pTDP-43-Belastung im frontalen Kortex aufwies, obwohl diese keine statistische Signifikanz erreichte (Abb. S3A). Von allen fünf kryptischen RNAs waren die Spiegel der kryptischen KCNQ2-RNA im frontalen Kortex und der kryptischen CAMK2B-RNA in der Amygdala bei TDP-43 Typ B FTLD-TDP nach Anpassung an Sterbealter, Geschlecht, RIN und pTDP-43 signifikant niedriger Ebenen (Tabelle S6). Für die anderen drei kryptischen RNAs wurden keine subtypspezifischen Unterschiede beobachtet (Tabelle S6). Bei AD-TDP wurde auch ein ähnliches TDP-43-Stufenschema beschrieben, wobei TDP-43 Typ α TDP-43 Typ A in FTLD-TDP ähnelt und TDP-43 Typ β häufig mit Neuronen assoziiert ist, die auch Tau-Aggregate in der AD-TDP aufweisen Form von NFTs [25, 26]. Ähnlich wie bei FTLD-TDP Typ B beobachtet, zeigten AD-TDP-Fälle mit TDP-43 Typ β eine geringere Akkumulation von pTDP-43, dies war jedoch nicht signifikant (Abb. S3B). Lediglich die kryptischen RNA-Spiegel von STMN2 in der Amygdala waren bei AD-TDP Typ β signifikant niedriger, nach Anpassung an Sterbealter, Geschlecht, RIN und pTDP-43-Spiegel (Tabelle S7). Auch hier gab es keine Veränderung in den Spiegeln der anderen kryptischen RNAs über die TDP-43-Subtypen hinweg (Tabelle S7). Insgesamt bestätigen unsere Ergebnisse einen starken Zusammenhang zwischen der Akkumulation kryptischer RNA und der pTDP-43-Belastung bei FTLD-TDP und AD-TDP. Darüber hinaus zeigten unsere Daten, dass die Akkumulation kryptischer RNA weitgehend unabhängig vom TDP-43-Subtyp war.

Um die Fähigkeit jeder kryptischen RNA zu bewerten, TDP-43-positive von TDP-43-negativen Fällen zu unterscheiden, führten wir Analysen der Receiver Operating Characteristic (ROC) durch und berechneten die Fläche unter der Kurve (AUC) für jede kryptische RNA in FTLD-TDP und AD-TDP im Vergleich zu Kontrollen. Wie erwartet war die Unterscheidungsfähigkeit aller fünf kryptischen RNAs in der Frontalrinde und der Amygdala bei FTLD-TDP hochsignifikant (P < 0,0001), wobei die AUC in der Amygdala zwischen 0,79 und 0,98 und in der Frontalrinde zwischen 0,81 und 0,94 lag (Abb. S4). . Die Unterscheidungsfähigkeit der kryptischen RNAs im Hippocampus von FTLD-TDP-Fällen war variabler (AUC: 0,67–0,95), aber immer noch statistisch signifikant (P <0,005, Abb. S4). Bei AD-TDP waren vier (STMN2, KCNQ2, UNC13A, SYT7) der fünf kryptischen RNAs in der Lage, TDP-43-Fälle von Kontrollen zu unterscheiden, sowohl in der Amygdala als auch im Hippocampus, obwohl die Signifikanz und AUC-Werte in der letzteren Region niedriger waren (Abb. 3A). Interessanterweise hatten die kryptischen RNA-Spiegel von KCNQ2 und UNC13A die signifikanteste Unterscheidungsfähigkeit bei AD-TDP. Bemerkenswert ist, dass das Muster der Unterscheidungsfähigkeit bei AD-TDP dem von FTLD-TDP ähnelte, wobei die kryptischen RNAs KCNQ2 und UNC13A die höchste Signifikanz und AUC-Werte aufwiesen (Abb. 3B). Insgesamt zeigen unsere Daten, dass kryptische RNA-Spiegel eine zuverlässige Fähigkeit zur Unterscheidung von TDP-43-positiven Fällen von Kontrollen sowohl bei FTLD-TDP als auch bei AD-TDP aufweisen.

Kryptische RNA kann AD-TDP-Fälle von Kontrollen unterscheiden. (A) Repräsentative Bilder der Unterscheidungsfähigkeit kryptischer RNAs, AD-TDP-Fälle von Kontrollen zu unterscheiden, ausgewertet durch Receiver Operating Characteristic (ROC)-Analysen, in der Amygdala (links; AD-TDP, N = 69; Kontrollen, N = 49) und Hippocampus (rechts; AD-TDP, N = 71; Kontrollen, N = 54). Die Werte der Fläche unter der Kurve (AUC), 95 %-Konfidenzintervalle (CI) und P-Werte für jede kryptische RNA sind in der unteren Tabelle enthalten. (B) Repräsentatives Bild des vergleichbaren Unterscheidungsfähigkeitsmusters kryptischer RNAs für AD-TDP- und FTLD-TDP-Fälle in der Amygdala

Eine TDP-43-Dysfunktion führt zu einem Mangel an Spleißunterdrückung, was zu einer aberranten Akkumulation kryptischer RNAs in ALS- und FTLD-TDP-Gehirnregionen mit ausgeprägter TDP-43-Pathologie führt [19, 27,28,29,30,31,32,33, 34,35]. Hier wollten wir beurteilen, inwieweit eine TDP-43-Dysfunktion auch bei AD-TDP vorliegt, indem wir die Anhäufung kryptischer RNAs, die für FTLD-TDP charakteristisch sind, in der Amygdala, im Hippocampus und im Frontalcortex beurteilen. In Übereinstimmung mit der topografischen Verteilung der TDP-43-Einschlüsse akkumuliert pTDP-43 in allen drei Regionen im FTLD-TDP signifikant, wobei Amygdala und Frontalkortex die höchste Belastung aufweisen. Im Gegensatz dazu kam es bei AD-TDP zu einer stärkeren Akkumulation in der Amygdala, gefolgt vom Hippocampus, und zu keiner nachweisbaren Akkumulation im frontalen Kortex. Letzteres ist nicht überraschend, da nur ein kleiner Teil der AD-TDP-Fälle eine TDP-43-Pathologie im frontalen Kortex aufweist [21,22,23]. Interessanterweise waren die pTDP-43-Spiegel in der Amygdala und im Hippocampus von AD-TDP niedriger als die von FTLD-TDP, selbst nach Korrektur von Störvariablen. Angesichts der Tatsache, dass der zeitliche Verlauf von FTLD-TDP relativ kürzer ist als der von AD-TDP, ist es verlockend zu spekulieren, dass eine verstärkte Ablagerung von pTDP-43 mit dem aggressiveren Krankheitsverlauf bei FTLD-TDP korrelieren könnte. Andererseits stellt die Akkumulation des pTDP-43-Proteins möglicherweise nur einen Bruchteil der verringerten Kernfunktion von TDP-43 dar. Tatsächlich wurde der Verlust von nuklearem TDP-43 ohne offensichtliche TDP-43-Pathologie mit Neurodegeneration in Verbindung gebracht [48, 49] und reicht aus, um kryptische TDP-43-RNA-Ziele zu akkumulieren [28, 41]. Daher kann die Bewertung von Spleißänderungen, die aus Aggregation oder verringerten Konzentrationen von nuklearem TDP-43 resultieren, zusätzliche Instrumente zur Beurteilung des Schweregrads der TDP-43-Dysfunktion liefern.

Es wurde festgestellt, dass sich mehrere kryptische RNAs sowohl in AD-TDP- als auch in FTLD-TDP-Gehirnen ansammeln, und zwar in den Regionen, die am stärksten von der TDP-43-Proteinopathie betroffen sind. Sie fehlten jedoch in kognitiv normalen Kontrollgehirnen und in AD-Gehirnen ohne TDP-Kontrolle. Insbesondere haben wir kryptische RNAs in STMN2 und UNC13A untersucht, die wir beide zuvor in FTLD-TDP-Fällen validiert hatten [29, 35]. STMN2 ist ein neuronales Phosphoprotein, das während der neuronalen Entwicklung und im erwachsenen Gehirn stark exprimiert wird [50]. Es ist an der Dynamik von Mikrotubuli beteiligt, spielt eine Rolle bei der axonalen Regeneration [51,52,53] und ist wichtig für die Aufrechterhaltung der neuromuskulären Verbindung [36,37,38,39]. Während bei AD bisher keine STMN2-Fehlverarbeitung aufgrund eines TDP-43-Funktionsverlusts berichtet wurde, wurden andere Mitglieder der Stathmin-Proteinfamilie mit der AD-Pathogenese in Verbindung gebracht. Beispielsweise waren die STMN1-Protein- und RNA-Spiegel in AD-Gehirnen verringert bzw. hochreguliert [54]. Interessanterweise korrelierten die Spiegel des STMN1-Proteins und die Anzahl der NFTs, jedoch nicht der Plaques, umgekehrt [54]. Die Akkumulation kryptischer STMN2-RNA bei ALS/FTLD-TDP geht mit einer Abnahme der STMN2-RNA und des Proteins in voller Länge einher [31, 32, 35]. Interessanterweise wurde festgestellt, dass STMN2 in voller Länge sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene bei AD unverändert war; Der TDP-43-Status dieser Fälle wurde jedoch nicht gemeldet [55]. Daher ist es möglich, dass kryptisches STMN2 oder die daraus resultierende Abnahme von STMN2 voller Länge eine pathogene Rolle bei AD-TDP spielt.

Es wurde zuvor berichtet, dass genetische Varianten am UNC13A-Locus ein erhöhtes Risiko für ALS/FTD mit sich bringen [56, 57], und neuere Studien zeigen, dass der Risiko-Haplotyp nicht nur im kryptischen Exon selbst lokalisiert ist, sondern auch zu einer verringerten Fähigkeit von TDP führt. 43 und andere hnRNPs zur Bindung und Unterdrückung des kryptischen Exon-Einschlusses in UNC13A [29, 30, 58]. Interessanterweise wurden reduzierte Unc13a-Spiegel mit einer beeinträchtigten Verarbeitung des Amyloid-Vorläuferproteins in Verbindung gebracht [59, 60], was darauf hindeutet, dass Veränderungen, die das UNC13A-Spleißen stromabwärts der TDP-43-Dysfunktion beeinflussen, bei AD schädlich sein können.

Wir beobachteten auch die Anreicherung kryptischer CAMK2B- und SYT7-RNAs in AD-TDP. Diese beiden Gene kodieren für Proteine, die an der kalziumabhängigen Regulierung des Membrantransports und der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Während weniger darüber bekannt ist, ob diese Gene AD beeinflussen können, wurden beide mit Veränderungen der synaptischen Plastizität in Mausmodellen von AD in Verbindung gebracht [61, 62]. Somit unterstreichen unsere Daten die Bedeutung von Veränderungen in diesen Genen für AD.

Eine Fehlfunktion von TDP-43 in FTLD-TDP und AD-TDP führt auch zu Fehlsplicing im Kaliumkanalregulator KCNQ2. Im Gegensatz zu den anderen kryptischen Spleißereignissen führt der Verlust von TDP-43 zum Ausschluss eines kanonischen Exons im Bild in KCNQ2 und nicht zum Einschluss eines neuen Exons. Dieses „skiptische“ Ereignis führt dazu, dass eine RNA, die für ein Protein kodiert, eine Sequenz der Porendomäne fehlt, die für die Kaliumleitung erforderlich ist. KCNQ2 ist Teil von M-Kanälen und Mutationen in KCNQ2 sind mit einer verminderten neuronalen Erregbarkeit und neonataler Epilepsie verbunden [63]. Tatsächlich wurde KCNQ2 mit einem kognitiven Rückgang während des normalen Alterns in Verbindung gebracht [64], und M-Kanal-Blocker wurden als potenzielle therapeutische Ziele zur Behandlung des kognitiven Rückgangs bei AD vorgeschlagen [63, 65]. Darüber hinaus wurde vermutet, dass die Ablagerung von Amyloid-Beta die KCNQ2-Spiegel beeinflussen kann [66, 67], was ihren möglichen Beitrag zur AD-Pathophysiologie weiter unterstützt.

Die Akkumulation kryptischer RNAs verlief parallel zum anatomischen Muster der pTDP-43-Akkumulation, wobei sowohl in der Amygdala als auch im Hippocampus hohe Konzentrationen von AD-TDP und FTLD-TDP auftraten. Während die Belastung durch kryptische RNAs zunächst in AD-TDP-Fällen im Vergleich zu FTLD-TDP sowohl in der Amygdala als auch im Hippocampus geringer zu sein schien, verschwanden diese Unterschiede nach Korrektur von Alter und Geschlecht. Die Akkumulation kryptischer RNAs war auch im Frontalcortex von FTLD-TDP hochsignifikant, wo die Belastung ähnlich der in der Amygdala war, der Frontalcortex von AD-TDP jedoch keine pTDP-43-Ablagerung und keine Kryptic-RNA-Akkumulation zeigte. Angesichts der Tatsache, dass die analysierten FTLD-TDP-Fälle eine kürzere Krankheitsdauer (Median 5 Jahre, Bereich: 1–25 Jahre) aufwiesen als AD-TDP-Fälle (Median 10 Jahre, Bereich: 3–23 Jahre), legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Häufung von Kryptische RNAs können in FTLD-TDP schneller sein. Gleichzeitig könnte die Ablagerung von TDP-43-Pathologie und kryptischen RNAs im frontalen Kortex bei FTLD-TDP einen aggressiveren Krankheitsphänotyp bei FTLD-TDP im Vergleich zu AD-TDP erklären. Warum die TDP-43-Dysfunktion im frontalen Kortex ein frühes Ereignis bei FTLD-TDP, aber spät bei AD-TDP ist, muss noch weiter untersucht werden.

Wir untersuchten auch, ob verschiedene TDP-43-Subtypen die Akkumulation von TDP-43-regulierten kryptischen RNA-Zielen beeinflussen könnten. Während einige kryptische RNAs in FTLD-TDP Typ B und AD-TDP Typ β in geringerem Maße vorhanden waren, gab es keine konsistenten Expressionsmuster über Ziele oder Gehirnregionen hinweg. Dies ist für AD-TDP interessant, da die gleichzeitige Ablagerung von TDP-43 in NFT bei AD-TDP Typ β häufig vorkommt, die TDP-43-Dysfunktion im Vergleich zu AD-TDP Typ α jedoch offenbar keinen Einfluss darauf hat. Insgesamt deuten unsere Studien darauf hin, dass die Akkumulation kryptischer RNA sowohl bei AD-TDP als auch bei FTLD-TDP auf den Verlust der TDP-43-Kernfunktion zurückzuführen ist, unabhängig vom TDP-43-Einschlusstyp, und dass eine TDP-43-Dysfunktion sowohl bei AD als auch bei FTLD zu einem gemeinsamen Ergebnis führen kann Krankheitsmechanismen.

Der spezifische Beitrag kryptischer RNAs zur Krankheitspathogenese bleibt unklar. Der Einschluss kryptischer Exons in einigen dieser Gene führt zu vorzeitigen Stoppcodons (STMN2, UNC13A, SYT7, CAMK2B), was zu einem schnellen Abbau der RNA oder ihrer jeweiligen verkürzten kodierten Proteine ​​führen kann. Andere führen zum Einbau von In-Frame-Exons ohne Einführung von Stoppcodons (KCNQ2) und führen zur Synthese stabiler Proteine ​​mit potenziell schädlichen Funktionen. Tatsächlich wurden einige dieser vorhergesagten kryptischen Peptide (KCNQ2, CAMK2B, SYT7) in Neuronen identifiziert, denen TDP-43 fehlt, und im Liquor von Patienten mit ALS/FTD [34]. Diese Studien unterstreichen nicht nur die Bedeutung des Verständnisses der Rolle dieser De-novo-Proteine ​​bei der Pathogenese von Krankheiten, sondern legen auch nahe, dass einige als Marker für eine TDP-43-Dysfunktion dienen könnten. Die Fähigkeit, kryptische RNAs zu erkennen, kann aufgrund der Transkripthäufigkeit unterschiedlich sein, da KCNQ2 und UNC13A sowohl bei AD-TDP als auch bei FTLD-TDP am besten mit der pTDP-43-Belastung assoziiert sind und TDP-43-positive Fälle konsistent von Kontrollen unterschieden werden. Unsere Beobachtung, dass einige der gleichen Ziele bei AD-TDP wie bei ALS und FTLD-TDP identifiziert wurden, legt nahe, dass Biomarker der bei ALS und FTD entwickelten TDP-43-Dysfunktion dazu dienen könnten, AD-Patienten mit TDP-43-Pathologie zu identifizieren. Da die TDP-43-Pathologie mit schlechteren Ergebnissen bei AD verbunden ist [14,15,16], ist ein tieferes Verständnis der Rolle von Missplicing-Ereignissen bei AD von größter Bedeutung.

Unsere Studie nutzte eine große Kohorte klinisch und pathologisch gut charakterisierter postmortaler Gewebe mit Analysen von drei verschiedenen Gehirnregionen, die für die TDP-43-Ablagerung relevant sind. Zusätzlich zur Einbeziehung kognitiv normaler Kontrollen tragen Fälle von AD ohne TDP-43-Pathologie eindeutig dazu bei, zu bestätigen, dass die Akkumulation kryptischer RNA bei AD von der TDP-43-Pathologie abhängt. Zu den weiteren Stärken der Studie gehören die Verwendung hochwertiger Gewebe (hoher RIN) und unsere Fähigkeit, die Belastung durch pTDP-43 und kryptische RNA zu quantifizieren. Unsere Studie weist auch einige Einschränkungen auf. Während wir einige kryptische RNAs untersuchten, wurden bei ALS/FTLD-TDP weitere kryptische RNAs beschrieben, die möglicherweise auch bei AD-TDP fehlreguliert sind. Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass wir den spezifischen Beitrag dieser Ziele zur Krankheit nicht kennen. Daher ist die Definition der funktionellen Auswirkungen der kryptischen RNA-Akkumulation auf die Pathobiologie bei AD ein wesentlicher zukünftiger Schritt. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass nur eine Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins kryptischer RNAs verwendet wurde. Zusätzliche Methoden wie Analysen von RNA-Sequenzierungsdaten oder RNA-basierte Bildgebungsstudien hätten zwar ihre Grenzen, wären aber von zusätzlichem Nutzen, wie wir bereits gezeigt haben [29, 35]. Obwohl unsere Daten schließlich zeigen, dass UNC13A und KCNQ2 TDP-43-Fälle am besten von Kontrollen unterscheiden konnten und dass sie besser mit der pTDP-43-Belastung sowohl bei AD-TDP als auch bei FTLD-TDP korrelierten, können wir nicht schließen, welche RNA oder Kombination von RNAs dies kann der beste Kandidat für die Entwicklung von Biomarkern sein. Tatsächlich könnte die Messung der Konzentration kryptischer Proteine ​​für die Bemühungen zur Entdeckung von Biomarkern relevanter sein.

Insgesamt stellten wir fest, dass sich kryptische RNAs, die durch TDP-43 reguliert werden, in Geweben und Krankheiten unterschiedlicher Genese, aber mit TDP-43-Pathologie ansammeln. Die Tatsache, dass kryptische RNAs bei ALS/FTLD-TDP auch in AD-TDP-Fällen akkumulieren, lässt auf einen gemeinsamen Mechanismus schließen, der Veränderungen im RNA-Metabolismus bei beiden Erkrankungen beinhaltet. Unsere Ergebnisse haben erhebliche Auswirkungen auf die Erweiterung unseres Verständnisses der Pathomechanismen von AD-TDP und unterstützen die Entwicklung von Biomarkern zur Identifizierung von AD-Fällen mit TDP-43-Pathologie. Zukünftige Bemühungen zur Wiederherstellung von Missplicing-Ereignissen aufgrund einer TDP-43-Dysfunktion könnten ein vielversprechender therapeutischer Ansatz für AD-TDP und ALS/FTLD-TDP sein. Beispielsweise reicht die Wiederherstellung des STMN2-Spleißens aus, um axonale Regenerationsdefizite aufgrund einer TDP-43-Dysfunktion wiederherzustellen [32]. Darüber hinaus kann die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden als wirksames Instrument zur Wiederherstellung von STMN2-Spleißdefekten in vivo dienen [42] und ist das Ziel laufender klinischer Studien (QRL-201-Studie: NCT05633459). Insgesamt wird erwartet, dass TDP-43-regulierte kryptische RNAs die Entwicklung von Werkzeugen nicht nur zur Beurteilung der TDP-43-Dysfunktion in Ante-Mortem-Bioflüssigkeiten erleichtern, sondern auch neue Ziele für therapeutische Interventionen darstellen, die mehreren TDP-43-Proteinopathien zugute kommen würden. einschließlich AD.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Amyotrophe Lateralsklerose

Alzheimer-Erkrankung

AD mit TDP-43-Pathologie

Fläche unter der Kurve

Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II Beta

Konfidenzintervall

Kognitiv normal

Liquor cerebrospinalis

Frontotemporale Lappendegeneration

FTLD mit TDP-43-Pathologie

Mitglied der Unterfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle 2

Limbisch vorherrschende, altersbedingte TDP-43-Enzephalopathie

Neurofibrillengewirr

RNA-Integritätsnummer

Betriebscharakteristik des Empfängers

Standardfehler des Mittelwerts

Stathmin 2

Synaptotagmin 7

Phosphoryliertes TDP-43

TAR-DNA-bindendes Protein 43 kDa

Unc-12-Homolog A

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Wir danken Wanhao Chi und Evangelos Kiskinis für die Entwicklung und Weitergabe der KCNQ2 qRT-PCR-Primer. Wir danken auch allen Patienten und ihren Familien für ihren Beitrag zu dieser Studie.

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (U54NS123743 an LP & MP; RF1NS120992 an MP und KAJ; R35NS097273 an LP; P01NS084974 an LP; R01AG37491 an KJ; P30AG062677 an RCP und LP; U19AG063911 an BFB und LP), Target ALS, unterstützt (an MP), das Robert Packard Center for ALS Research an der Johns Hopkins University (an LP), ein BrightFocus ADR Grant (A2020279F an SP).

Abteilung für Neurowissenschaften, Mayo Clinic, Jacksonville, FL, USA

Virginia Estates Ayuso, Sarah Pickles, Tiffany Todd, Mei Yue, Karen Jansen-West, Yuping Song, Jesus Gonzalez Bejarano, Bailey Rawlinson, Michael DeTure, Dennis W. Dickson, Leonard Petrucelli und Mercedes Prudencio

Graduiertenprogramm für Neurowissenschaften, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Jacksonville, FL, USA

Virginia Estates Ayuso, Sarah Pickles, Tiffany Todd, Michael DeTure, Dennis W. Dickson, Leonard Petrucelli und Mercedes Prudence

Abteilung für Neurologie, Mayo Clinic, Jacksonville, FL, USA

Neill R. Graff-Radford

Abteilung für Neurologie, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Bradley F. Boeve, David S. Knopman, Ronald C. Petersen und Keith A. Josephs

Abteilung für Forschung, Neurowissenschaften, Mayo Clinic College of Medicine, 4500 San Pablo Rd, Jacksonville, FL, 32224, USA

Mercedes Prudencio

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VEA, KAJ, DWD, LP und MP konzipierten und gestalteten die Studie. VEA und MP führten die Untersuchung durch. VEA, SP, MY, KJ-W, YS, JGB und MP entwickelten die Laborarbeit. BR, MD, NRG, BFB, DSK, RCP, DWD, KAJ und LP stellten Ressourcen zur Verfügung. VEA und MP führten die Datenkuratierung und formale Analyse durch und verfassten den ursprünglichen Manuskriptentwurf, der von allen Co-Autoren überprüft und von VEA, SP, TT, DSK, DWD, KAJ und MP weiter bearbeitet wurde. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Mercedes Prudencio.

Menschliches postmortales Gehirngewebe aus Amygdala, Hippocampus und frontalem Kortex wurde von der Mayo Clinic Florida Brain Bank bereitgestellt. Die Diagnose wurde unabhängig von ausgebildeten Neurologen und Neuropathologen anhand neurologischer bzw. pathologischer Untersuchungen gestellt. Alle Teilnehmer oder die nächsten Angehörigen gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und alle Protokolle wurden vom Institutional Review Board und der Ethikkommission der Mayo Clinic überprüft und genehmigt.

Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und stimmen der Veröffentlichung zu.

BFB erhält institutionelle Forschungsstipendien von Alector, Biogen, Transposon, Cognition Therapeutics und GE Healthcare. BFB erhält Honorar für SAB-Aktivitäten für das Tau-Konsortium. LP ist Berater für Expansion Therapeutics. DSK ist Mitglied eines Data Safety Monitoring Board für die Dominantly Inherited Alzheimer Network Treatment Unit-Studie. DSK war Mitglied eines Data Safety Monitoring Board für ein Tau-Therapeutikum für Biogen (bis 2021), erhielt jedoch keine persönliche Vergütung. DSK ist Prüfarzt in klinischen Studien, die von Biogen, Lilly Pharmaceuticals und der University of Southern California gesponsert werden. DSK war als Berater für Roche, Samus Therapeutics, Magellan Health, Biovie und Alzeca Biosciences tätig, erhält jedoch keine persönliche Vergütung. DSK nahm am 2. Dezember 2022 an einer Eisai-Beiratssitzung für Lecanemab teil, erhielt jedoch keine Vergütung. DSK erhält Mittel vom NIH. Alle anderen Autoren erklären keine Offenlegungen oder Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dem Inhalt des Artikels.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Estades Ayuso, V., Pickles, S., Todd, T. et al. TDP-43-regulierte kryptische RNAs reichern sich im Gehirn von Alzheimer-Patienten an. Mol Neurodegeneration 18, 57 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00646-z

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Eingegangen: 22. Mai 2023

Angenommen: 04. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00646-z

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